文章目录
摘要
ABSTRACT
英文缩写词表
第一章 文献综述 水产品中副溶血性弧菌风险评估研究现状及展望
1.1 中国水产品生产与消费现状
1.2 水产品中常见食源性致病菌
1.3 副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.3.1 国外副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.3.2 国内副溶血性弧菌风险评估研究现状
1.4 副溶血性弧菌风险评估三大核心步骤的研究现状与展望
1.5 副溶血性弧菌危害识别技术的研究现状与展望
1.5.1 平板计数法
1.5.2 最大或然数方法
1.5.3 免疫试纸条
1.5.4 基于RNA的检测方法
1.5.5 qPCR活菌定量方法
1.5.6 副溶血性弧菌危害识别技术研究的展望
1.6 副溶血性弧菌暴露评估模型的研究现状与展望
1.6.1 预测微生物学研究进展
1.6.2 副溶血性弧菌预测微生物学研究进展与展望
1.6.3 应用概率分布描述副溶血性弧菌浓度的研究现状与展望
1.7 副溶血性弧菌危害特征描述的研究现状与展望
1.7.1 副溶血性弧菌致病性相关毒力蛋白结构生物学研究现状
1.7.1.1 耐热直接溶血素蛋白(TDH)
1.7.1.2 幼虾急性肝胰腺坏死病致病蛋白pirA/B
1.7.1.3 三型分泌系统结构蛋白VtrA/VtrB/VtrC
1.7.1.4 三型分泌系统效应蛋白VopL
1.7.2 副溶血性弧菌致病性相关毒力蛋白结构生物学展望
1.7.2.1 耐热相关溶血素蛋白(TRH)
1.7.2.2 三型分泌系统(T3SS)及其效应物蛋白(T3SE)
1.7.2.3 外膜生物合成转运系统
1.8 本课题的研究方案
参考文献
第二章 基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术研究
2.1 引言
2.2 实验材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.2 副溶血性弧菌和霍乱弧菌菌株
2.2.3 活菌DNA快速筛选仪器的设计图
2.2.4 基于活菌DNA筛选仪器的PMA前处理过程
2.2.5 引物、探针及PCR反应条件
2.2.6 PMA两重qPCR技术的特异性分析
2.2.7 PMA两重qPCR技术标准曲线的构建
2.2.8 致病性弧菌死菌的制备
2.2.9 PMA两重qPCR在人工接种样品中的应用
2.2.10 PMA两重qPCR在实际水产样品中的应用
2.3 结果与讨论
2.3.1 活菌DNA快速筛选仪器的构建
2.3.2 PMA两重qPCR的特异性分析
2.3.3 PMA两重qPCR的扩增效率
2.3.4 PMA两重qPCR最低定量限
2.3.5 PMA两重qPCR在人工接种样本中区分死活菌的研究
2.3.6 PMA两重qPCR在实际水产样本中的应用
2.4 本章小结
参考文献
第三章 基于概率分布构建副溶血性弧菌暴露评估中描述细菌生长速率和浓度的随机模型研究
第一节 南美白对虾中副溶血性弧菌随机预测生长模型的研究
3.1.1 引言
3.1.2 材料与方法
3.1.2.1 副溶血性弧菌菌株生长信息的收集
3.1.2.2 南美白对虾中副溶血性弧菌生长数据的整合及二级模型的构建及验证
3.1.2.3 南美白对虾中副溶血性弧菌随机预测生长模型的构建
3.1.3 结果与分析
3.1.3.1 副溶血性弧菌生长特性信息库构建
3.1.3.2 副溶血性弧菌最大比生长速率二级模型的构建与验证
3.1.3.3 副溶血性弧菌最大比生长速率的随机预测模型
3.1.4 讨论
3.1.5 小结
第二节 水产品中副溶血性弧菌污染量描述的概率评估模型研究
3.2.1 引言
3.2.2 材料与方法
3.2.2.1 样品采集
3.2.2.2 MPN-PCR法
3.2.2.3 统计分析
3.2.2.4 使用概率分布描述细菌污染
3.2.3 结果和讨论
3.2.3.1 上海市大型超市水产品中副溶血性弧菌的污染情况分析
3.2.3.2 最适概率分布的选择
3.2.4 小结
参考文献
第四章 副溶血性弧菌危害特征关键毒力蛋白VopA表达纯化与结晶条件的筛选
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 VopA蛋白的生物信息学分析
4.2.3 6His-MBP-TEV-VopA重组表达载体的构建
4.2.4 6His-TEV-VopA重组表达载体的构建
4.2.5 VopA重组蛋白的诱导表达
4.2.6 VopA重组蛋白的提取
4.2.7 VopA重组蛋白的纯化
4.2.8 Tev酶切及VopA重组蛋白的二次纯化
4.2.9 VopA蛋白结晶条件的筛选
4.3 结果与讨论
4.3.1 VopA蛋白的生物信息学分析结果
4.3.1.1 VopA蛋白理化性质分析
4.3.1.2 VopA蛋白信号肽与跨膜区域预测与分析
4.3.1.3 VopA蛋白的二级结构预测与分析
4.3.1.4 VopA蛋白的三级结构预测与分析
4.3.2 VopA表达载体构建结果
4.3.3 6His-MBP-Tev-VopA重组蛋白的表达与纯化
4.3.4 6His-Tev-VopA重组蛋白的表达与纯化
4.3.5 6His-Tev-VopA重组蛋白的大规模制备
4.3.6 VopA蛋白结晶条件的筛选
4.4 本章小结
参考文献
全文总结
本研究不足与展望
附录
在上海海洋大学就读博士期间取得的科研成果
致谢
文章摘要:中国是水产品生产与消费的大国,研究数据显示,2001年至今,我国的水产品生产与消费均在逐年递增,生产与消费量常年位于世界第一。副溶血性弧菌是水产品中最为常见的食源性致病菌,严重威胁着水产品质量与安全,制约着水产行业的健康可持续发展。微生物风险评估是控制水产品中副溶血性弧菌危害的重要手段和工具,可有效控制副溶血性弧菌的潜在风险。本文针对副溶血性弧菌风险评估中危害识别、暴露评估、危害特征描述这3大核心部分的缺陷与不足展开攻关,进行了基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术研究、基于概率分布构建副溶血性弧菌暴露评估中描述细菌生长速率和浓度的随机模型研究、以及副溶血性弧菌关键危害特征的毒力蛋白VopA晶体学的初步研究。主要研究内容和研究结果如下:1.基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术研究传统副溶血性弧菌危害识别技术较少关注水产品中死活菌的问题,常把死活菌的数量共同计算入风险评估中,导致其患病风险的错误估计,造成了副溶血性弧菌风险评估的不确定性。为了更准确地识别副溶血性弧菌的实际危害,亟需发展一套基于活菌DNA的副溶血性弧菌危害识别新技术,用以正确评估副溶血性弧菌的真实风险。叠氮溴化丙锭（PMA）是一种光敏型核酸染料,其与q PCR技术相结合,可以选择性地识别水产品中副溶血性弧菌的活菌DNA,从而达到活菌定量检测的目的。PMA-q PCR的前处理过程包括两个关键步骤:暗处理和光交联,这样的操作方法较为繁琐,不符合现今快速检测技术的发展趋势。本研究针对这一弊端,构建了一种新型的可用于PMA-q PCR前处理的活菌DNA筛选仪器,将暗处理和光交联两个核心步骤合二为一。结果显示:该仪器可根据自身实验需求选择不同的PMA前处理条件,包括PMA暗处理时间、光处理时间以及混匀速度的设定。通过温度检测器进行实际测量,在该仪器连续使用的6h内,腔体温度没有明显的变化,不会损伤待测样品中的活菌DNA。该仪器实现了PMA前处理过程的一体化和全自动化,在源头上简化了PMA-q PCR的前处理过程,提升了PMA的处理效率,能够用于活菌DNA的高效筛选,为活菌定量技术提供了可靠的工具保障。本研究进一步基于该活菌DNA筛选仪器,结合PMA和多重q PCR的优点,针对两种常见的水产源致病菌副溶血性弧菌和霍乱弧菌,构建了PMA两重q PCR技术,可以用于定量检测水产品及水产相关环境中副溶血性弧菌和霍乱活菌的活菌细胞。结果表明:本研究所构建的PMA两重q PCR技术在不同样品中的扩增效率均能保持在90%-110%之间,并具有较低的检测限:在对虾养殖环境水体中,最低定量限可达到101-102 CFU/m L,在南美白对虾和太平洋牡蛎中,最低定量限为102-103 CFU/g。该方法具备良好的区分死活菌的能力,能够在106 CFU/m L（g）死菌存在的情况下,准确定量水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的活菌。进一步将该方法应用于真实水产样品中弧菌的检测,结果显示该技术的检测结果与ISO方法保持一致。本部分研究构建了一种用于PMA-q PCR前处理的活菌DNA筛选仪器,并基于该仪器构建了水产品中常见弧菌的活菌定量检测技术,为副溶血性弧菌的危害识别提供了新的检测与分析工具。2.基于概率分布构建副溶血性弧菌暴露评估中描述细菌生长速率和浓度的随机模型研究运用数学模型描述细菌的生长速率和浓度,是风险评估中暴露评估的两大核心组成部分。然而现阶段描述的副溶血性弧菌生长速率和浓度的模型大多为确定性模型,缺少基于概率分布的随机模型研究。将概率分布应用于暴露评估之中以开发新的随机模型,是准确评估副溶血性弧菌风险的关键。本部分研究首先收集了最为全面的副溶血性弧菌生长数据,构建了弧菌生长特性信息数据库。并基于该数据库,整合了5组南美白对虾中副溶血性弧菌生长传统模型和分子模型的数据,探究了最适合描述平方根模型参数b和T0的概率分布。结果表明,最适合描述平方根模型参数b的概率分布为Normal分布,其分布拟合公式为Normal（0.0342,0.0068）。最适合描述平方根模型参数T0的概率分布为Uniform分布,其分布拟合公式为Uniform（-9.7625,3.6925）。并以此为基础,修正了传统的平方根模型,构建了副溶血性弧菌在南美白对虾中生长的随机模型。进一步针对992份来自于上海大型超市的水产品,运用MPN-PCR计数法进行副溶血性弧菌污染情况分析。同时,选用两个常用于暴露评估中的概率分布:Lognormal分布和整合概率分布,来描述水产品中细菌的浓度。结果表明:上海大型超市中的水产品致病性副溶血性弧菌检出率（1.71%）与几何平均浓度相对较低（0.1581 MPN/g）。运用Lognormal分布和整合概率分布描述副溶血性弧菌的结果没有明显差异,建议在今后的副溶血性弧菌的暴露评估中,运用更为简单有效的Lognormal分布来描述副溶血性弧菌在水产品中的浓度。本部分研究构建了副溶血性弧菌生长速率随机模型和浓度最适概率分布模型,弥补了传统确定性模型的不足,为解决副溶血性弧菌暴露评估的不确定性和变异性问题提供了技术支持,为提升副溶血性弧菌风险评估的准确性奠定了模型基础。3.副溶血性弧菌危害特征关键毒力蛋白VopA表达纯化与结晶条件的筛选微生物风险评估中危害特征描述的关键在于定性或定量地分析致病菌的危害程度,副溶血性弧菌致病机理的研究有助于更好地理解该菌的危害特征。VopA是副溶血性弧菌三型分泌系统II重要的毒力效应蛋白,属于Yop J家族。目前VopA蛋白的具体三维结构尚属未知,大大制约了人们对其致病机制的理解。本部分研究首先采用生物信息学的方法对副溶血性弧菌危害特征关键毒力蛋白VopA理化性质、跨膜结构区域、信号肽、二级结构、三级结构等进行了预测分析。结果显示:VopA蛋白由289个氨基酸组成,分子结构式为C1410H2311N401O439S20,相对分子质量为32.55 KDa,原子总数为4581,平均亲水性为-0.404,为亲水性蛋白,摩尔吸收系数为0.286 m2/mol。该蛋白无显著的信号肽切割位点,无跨膜区域。二级结构的主要由α-螺旋和延伸链构成。通过三级结构分析可知,该蛋白与六磷酸肌醇（IP6）可能会形成较为稳定的晶体结构。进一步通过SLIC分子克隆技术构建了VopA蛋白的重组表达载体6His-MBP-TEV-VopA和6His-TEV-VopA,将其导入大肠杆菌BL21（DE3）中,在诱导剂IPTG的作用下进行异源蛋白的诱导表达。运用超声波技术破碎菌体,并提取上清液中的目的蛋白。再通过运用凝胶层析技术对VopA蛋白进行纯化,获得了高纯度的VopA蛋白。并利用蛋白质结晶条件筛选机器人结合常用结晶条件筛选试剂盒,对VopA蛋白的结晶条件进行了初步筛选,在JCSG-plus?试剂盒的C3孔中获得了VopA-IP6复合物的蛋白结晶条件:0.2M硝酸铵、20%（w/v）PEG3350。后续研究可基于该结晶条件进行进一步的优化,以获得更高质量的蛋白晶体。本部分研究为副溶血性弧菌三型分泌系统II效应蛋白VopA结构和功能的进一步揭示提供了重要的数据支持,为副溶血性弧菌危害特征的描述和致病机理的揭示奠定了基础。结论:本研究针对微生物风险评估中危害识别、暴露评估、危害特征描述3方面展开研究,系统地构建了水产品中致病性弧菌的危害识别新技术,探究了可服务于暴露评估的随机模型,提升了暴露评估模型的准确性,为副溶血性弧菌的风险评估提供了关键的技术支撑;并进行了副溶血性弧菌重要毒力效应蛋白VopA的表达纯化与结晶条件的筛选,为副溶血性弧菌危害特征描述及致病机理的揭示奠定基础。本研究的结论,可为更有效地评估和控制副溶血性弧菌的风险提供技术上和理论上支持,从而达到保障水产行业健康发展、提升水产品质量与品质、维护公众免遭致病菌侵害的目的。
文章关键词:副溶血性弧菌,风险分析关键技术,活菌检测技术,随机模型,毒力蛋白VopA,
作者单位:张昭寰
论文DOI: 10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000225
论文分类号: TS254.1
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文章来源：上海海洋大学学报 网址: http://shhydxxb.400nongye.com/lunwen/itemid-70676.shtml
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